Polymerase-Kettenreaktion

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Polymerase-Kettenreaktion

Stichpunkte

Allgemein
	PCR) ist eine Methode
	ohne einen lebenden Organismus
	Die Polymerase-Kettenreaktion (englisch Polymerase Chain Reaction
	wie z
	um die Erbsubstanz DNA zu vervielfÃ¤ltigen
	B. das Bakterium Escherichia coli oder die BÃ¤ckerhefe Saccharomyces cerevisiae zu benutzen
	zum Beispiel fÃ¼r die Erkennung von Erbkrankheiten
	Die PCR wird in biologischen und medizinischen Laboratorien fÃ¼r eine Vielzahl verschiedener Aufgaben verwendet
	fÃ¼r das Erstellen und ÃœberprÃ¼fen genetischer FingerabdrÃ¼cke
	fÃ¼r das Klonieren von Genen und fÃ¼r Vaterschaftstests. Inhaltsverzeichnis showTocToggle("Anzeigen"
	"Verbergen") 1 Geschichte 2 PCR in der Praxis 3 Ablauf 4 Beispiel 5 Schritte des PCR-Prozesses 6 PCR-Anwendungsgebiete 6.1 Genetischer Fingerabdruck 6.2 Vaterschaftstest 6.3 Erkennung von Erbkrankheiten 6.4 Klonierung von Genen 6.5 Mutagenese 6.6 Analyse alter (fossiler) DNA 7 WeiterfÃ¼hrende Literatur 8 Siehe auch 9 Weblinks [Bearbeiten]
Geschichte
	Die Polymerase-Kettenreaktion wurde in den frÃ¼hen 1980er Jahren von Kary Banks Mullis entwickelt
	Nur sieben Jahre nachdem er seine Idee verÃ¶ffentlicht hatte
	wurde Mullis hierfÃ¼r der Nobelpreis fÃ¼r Chemie verliehen
	das DNA durch wiederholte Verdoppelung in mehreren Zyklen mit Hilfe eines Enzyms namens DNA-Polymerase kÃ¼nstlich vervielfÃ¤ltigt
	ein Verfahren zu entwickeln
	Seine Idee war es
	sie verdoppelt die DNA vor der Zellteilung
	DNA-Polymerase kommt in allen Lebewesen vor
	Sie bindet an einen einzelnen DNA-Strang und erzeugt einen dazu komplementÃ¤ren Strang
	Bereits in Mullis' ursprÃ¼nglichem PCR-Versuch wurde das Enzym in vitro verwendet
	Die doppelstrÃ¤ngige DNA wurde durch Erhitzen auf 96 Â°C in zwei EinzelstrÃ¤nge aufgeteilt
	Bei dieser Temperatur wurde die DNA-Polymerase zerstÃ¶rt und musste daher nach jedem Erhitzen erneuert werden
	da es viel Zeit
	groÃŸe Mengen DNA-Polymerase und stÃ¤ndige Aufmerksamkeit erforderte
	Mullis' ursprÃ¼ngliches Verfahren war sehr ineffizient
	SpÃ¤ter wurde der PCR-Prozess verbessert
	indem man die DNA-Polymerase von thermophilen (Hitze liebenden) Bakterien verwendete
	die bei Ã¼ber 110 Â°C in Geysiren leben
	Die DNA-Polymerase dieser Lebewesen ist thermostabil (stabil bei hohen Temperaturen) und wurde daher beim Erhitzen wÃ¤hrend der PCR-Zyklen nicht zerstÃ¶rt
	Da nicht mehr stÃ¤ndig neue DNA-Polymerase hinzugefÃ¼gt werden musste
	konnte der VervielfÃ¤ltigungs-Vorgang erheblich vereinfacht und automatisiert werden
	Eine der ersten thermostabilen DNA-Polymerasen wurde aus Thermophilus aquaticus gewonnen und Taq genannt.Taq-Polymerase erfÃ¤hrt gegenwÃ¤rtig (Mai 2004) breite Anwendung
	Ein Nachteil der Taq-Polymerase liegt darin
	was zu Mutationen (Fehlern) in der DNA-Sequenz fÃ¼hrt
	dass sie manchmal Fehler beim Kopieren der DNA produziert
	Polymerasen wie Pwo oder Pfu
	der die Anzahl der Mutationen in der kopierten DNA erheblich senkt. [Bearbeiten]
	die aus Archaea gewonnen werden
	haben einen Korrektur-Mechanismus
PCR in der Praxis
	PCR wird eingesetzt um einen kurzen
	genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfÃ¤ltigen
	Dabei kann es sich um ein Gen oder auch nur um einen Teil eines Gens handeln oder auch um nicht codierende DNA Sequenzen
	Im Gegensatz zu lebenden Organismen kann der PCR-Prozess nur kurze DNA-Abschnitte bis zu ca
	10 kbp (10.000 Basenpaare) kopieren
	und daher wird ihre LÃ¤nge in komplementÃ¤ren DNA-Bausteinen (NukleinsÃ¤uren) oder Basenpaaren gemessen
	DNA ist doppelstrÃ¤ngig
	Mit Hilfe bestimmter Verfahren kÃ¶nnen Fragmente bis zu einer LÃ¤nge von 40 kbp vervielfÃ¤ltigt werden
	was immer noch sehr viel weniger ist als die chromosomale DNA einer eukaryotischen Zelle - eine menschliche Zelle enthÃ¤lt beispielsweise etwa drei Milliarden Basenpaare
	In ihren momentanen Anwendungsgebieten benÃ¶tigt PCR mehrere grundlegende Komponenten
	um Anfang und Ende des zu vervielfÃ¤ltigenden Abschnitts festzulegen (siehe auch den Abschnitt "Primer") DNA-Polymerase
	die Bausteine fÃ¼r den von der DNA-Polymerase synthetisierten DNA-Strang PufferlÃ¶sungen
	die eine fÃ¼r die DNA-Polymerase geeignete chemische Umgebung sicherstellen Die Polymerase-Kettenreaktion findet in einem so genannten Thermocycler statt
	um den festgelegten Abschnitt zu kopieren Nukleotide
	die den zu vervielfÃ¤ltigenden Abschnitt enthÃ¤lt Zwei Primer
	Diese sind: Die Original-DNA
	die fÃ¼r den jeweiligen Schritt benÃ¶tigt wird
	Diese Maschine erhitzt und kÃ¼hlt die in ihr befindlichen ReaktionsgefÃ¤ÃŸe prÃ¤zise auf die Temperatur
	Um Verdunstung zu verhindern
	wird ein beheizbarer Deckel auf den ReaktionsgefÃ¤ÃŸen oder eine Ã–lschicht auf dem Reaktionsgemisch benutzt. [Bearbeiten]
Ablauf
	Der PCR-Prozess besteht aus einer Serie von 20 bis 30 Zyklen
	Jeder Zyklus besteht aus drei Schritten (Abb
	1)
	ZunÃ¤chst wird die doppelstrÃ¤ngige DNA auf 96 Â°C erhitzt um die StrÃ¤nge zu trennen
	Dieser Schritt wird Melting (Schmelzen) genannt
	Die WasserstoffbrÃ¼ckenbindungen
	werden aufgebrochen
	die die beiden DNA-StrÃ¤nge zusammenhalten
	Im ersten Zyklus wird die DNA oft fÃ¼r lÃ¤ngere Zeit erhitzt um sicherzustellen
	dass sich sowohl die Ausgangs-DNA als auch die Primer vollstÃ¤ndig voneinander getrennt haben und nur noch EinzelstrÃ¤nge vorliegen
	so dass die Primer sich an die einzelnen DNA-StrÃ¤nge anlagern kÃ¶nnen
	Nach der Trennung der StrÃ¤nge wird die Temperatur gesenkt
	Dieser Schritt heiÃŸt Annealing (Anlagern)
	Die Temperatur wÃ¤hrend dieser Phase hÃ¤ngt von den Primern ab und liegt normalerweise 5 Â°C unter ihrem Schmelzpunkt
	Wird die Temperatur falsch gewÃ¤hlt
	dass die Primer sich nicht oder an der falschen Stelle an der Ausgangs-DNA anlagern
	kann das dazu fÃ¼hren
	SchlieÃŸlich fÃ¼llt die DNA-Polymerase die fehlenden StrÃ¤nge mit Nukleotiden auf
	Sie beginnt am angelagerten Primer und folgt dann dem DNA-Strang
	Dieser Schritt heiÃŸt Elongation (VerlÃ¤ngerung)
	die dieser Schritt benÃ¶tigt
	von der DNA-Polymerase und der LÃ¤nge des DNA-Fragments
	das vervielfÃ¤ltigt werden soll
	Die Temperatur hÃ¤ngt nun von der DNA-Polymerase ab
	die Zeit
	die Menge an DNA verdoppelt sich also mit jedem neuen Zyklus. [Bearbeiten]
	Sie liegt zwischen 68 und 72 Â°C. Abbildung 1: Schematische Darstellung des PCR-Zyklus. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur VerfÃ¼gung gestellt.) Schmelzen bei 96 Â°C. Anlagerung bei 68 Â°C. VerlÃ¤ngerung bei 72 Â°C (P=Polymerase). Der erste Zyklus ist beendet. Die beiden entstandenen DNA-StrÃ¤nge bilden die Vorlage fÃ¼r den nÃ¤chsten Durchlauf
Beispiel
	Die angegebenen Zeiten und Temperaturen dieses Beispiels stammen aus einem PCR-Programm
	das von Magnus Manske erfolgreich zur VervielfÃ¤ltigung eines 250-bp-Fragment des C-terminalen Endes des insulinartigen Wachstumsfaktor (IGF) (engl. insulin-like growth factor) eingesetzt wurde
	0 Âµl Pfu-Polymerase 1
	0 Âµl Nukleotiden 5
	5 Âµl H2O Ein 200 Âµl ReaktionsgefÃ¤ÃŸ mit den 100 Âµl Gemisch wird in den Thermocycler gestellt. [Bearbeiten]
	Das Reaktionsgemisch besteht aus: 1
	5 Âµl Primer
	0 Âµl DNA-Vorlage (100 ng/Âµl) 2
	1
	0 Âµl PufferlÃ¶sung 89
	25 Âµl pro Primer (100 ng/Âµl) 1
Schritte des PCR-Prozesses
	Schritt 1: Initialisierung
	dass die DNA-StrÃ¤nge und Primer sich getrennt haben
	um sicherzustellen
	Das Gemisch wird 5 Minuten lang auf 96 Â°C erhitzt
	Die DNA-Polymerase kann vor oder nach der Initialisierung zugefÃ¼gt werden
	Schritt 2: Zerlegen
	Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 96 Â°C halten
	um die DNA wÃ¤hrend der Zyklen zu zerlegen
	Das genÃ¼gt gewÃ¶hnlich
	Schritt 3: Anlagerung
	Die Temperatur 30 Sekunden lang auf 68 Â°C halten
	Schritt 4: VerlÃ¤ngerung
	Die Temperatur 45 Sekunden lang auf 72 Â°C halten. Die Schritte 2-4 werden 25 mal wiederholt. Mit guten Primern und frischer Polymerase genÃ¼gen 15 bis 20 Zyklen
	Schritt 5: Das Gemisch wird bei 7 Â°C aufbewahrt
	Es bietet sich an
	die PCR am Abend vor dem Verlassen des Labors einzuleiten
	so dass sie Ã¼ber Nacht laufen kann
	Die DNA wird bei 7 Â°C nach nur einer Nacht nicht beschÃ¤digt
	Das PCR-Produkt kann durch Agarose-Gelelektrophorese anhand seiner GrÃ¶ÃŸe identifiziert werden. (Die Agarose-Gelelektrophorese ist eine Prozedur
	bei der DNA in ein Agarose-Gel eingebracht wird und anschlieÃŸend eine Spannung angelegt wird
	Dann bewegen sich die kÃ¼rzeren DNA-StrÃ¤nge schneller als die lÃ¤ngeren auf den Pluspol zu.) Die Menge des PCR-Produkts kann durch einen Vergleich mit DNA-Leiter
	die DNA-Fragmente bekannter GrÃ¶ÃŸe (auch in Gel) enthÃ¤lt
	bestimmt werden. Abbildung 2 : Das PCR-Produkt im Vergleich mit der DNA-Leiter in Agarose-Gel. (Das Bild wurde vom Autor erstellt und mit Genehmigung von Helmut W
	verÃ¶ffentlicht) DNA-Leiter (Bande 1)
	Das PCR-Produkt in niedriger Konzentration (Bande 2) und hoher Konzentration (Bande 3). [Bearbeiten]
	Institut fÃ¼r Biochemie
	Klein
	UniversitÃ¤t zu KÃ¶ln
PCR-Anwendungsgebiete
	Die PCR kann fÃ¼r eine Vielzahl von Experimenten und Analysen eingesetzt werden
	einige Beispiele werden weiter unten vorgestellt. [Bearbeiten]
Genetischer Fingerabdruck
	indem seine oder ihre DNA mit einer vorhandenen Probe verglichen wird
	Der genetische Fingerabdruck wird in der Gerichtsmedizin zur Identifikation einer Person eingesetzt
	Beispielsweise kann eine Blutprobe von einem Verbrechensschauplatz mit dem Blut eines VerdÃ¤chtigen verglichen werden
	die man aus Blut
	Speichel
	Sperma
	Haaren oder Ã¤hnlichem gewinnen kann
	Die Probe muss nur geringe Mengen von DNA enthalten
	Theoretisch genÃ¼gt ein einziger Strang
	die dann mittels PCR vervielfÃ¤ltigt werden
	Zuerst spaltet man die DNA-Probe in Fragmente auf
	Die vervielfÃ¤ltigten Fragmente werden anschlieÃŸend durch Gelelektrophorese getrennt
	Die so gewonnene Anordnung der DNA-Fragmente nennt man DNA-Fingerabdruck
	Diese Fragmente enthalten jedoch grÃ¶ÃŸtenteils polymorphe Bereiche
	sogenannte repetetive Sequenzen
	Das sind sich wiederholende DNA-Abschnitte im nicht codierenden Bereich der DNA (junk DNA)
	Diese Sequenzen liegen zwischen den Genen
	Deshalb lÃ¤sst sich anhand des genetischen Fingerabdrucks keine Disposition feststellen. [Bearbeiten]
Vaterschaftstest
	zum Beispiel zwischen Eltern und Kindern oder zwischen Geschwistern durch zwei oder mehr genetische FingerabdrÃ¼cke bestimmt werden
	Obwohl diese erzeugten "FingerabdrÃ¼cke" einzigartig sind (auÃŸer bei eineiigen Zwillingen)
	was bei Vaterschaftstests zum Einsatz kommt (Abb
	kÃ¶nnen genetische Beziehungen
	3)
	Eine Abwandlung dieser Technik wird auch zur Bestimmung evolutionÃ¤rer Beziehungen zwischen Organismen angewandt. Abbildung 3: Elektrophorese mittels PCR vervielfÃ¤ltigter DNA-Fragmente. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde der Wikipedia zur VerfÃ¼gung gestellt.) (1) Vater. (2) Kind. (3) Mutter
	Das Kind hat Teile der FingerabdrÃ¼cke der beiden Elternteile geerbt wodurch es Ã¼ber einen eigenen
	einzigartigen Fingerabdruck verfÃ¼gt. [Bearbeiten]
Erkennung von Erbkrankheiten
	der durch den Einsatz von PCR bedeutend verkÃ¼rzt werden kann
	Die Erkennung von Erbkrankheiten in einem vorliegenden Genom ist ein langwieriger und komplizierter Vorgang
	die Sequenz der Nukleotide (oder Basen) der DNA zu bestimmen)
	das in Frage kommt
	kann durch PCR mit den entsprechenden Primern amplifiziert (= vervielfÃ¤ltigt) und anschlieÃŸend sequenziert werden (DNA sequenzieren heiÃŸt
	Jedes Gen
	um Mutationen aufzuspÃ¼ren
	indem man die Virus-DNA vervielfÃ¤ltigt
	Virale Erkrankungen kÃ¶nnen ebenfalls durch PCR erkannt werden
	oft Tage oder Wochen vor dem Auftreten der Symptome
	Diese Analyse kann sofort nach der Infektion erfolgen
	Erfolgt die Diagnose so frÃ¼h
	erleichtert das den Medizinern die Behandlung erheblich. [Bearbeiten]
Klonierung von Genen
	Das Klonieren eines Gens - nicht zu verwechseln mit dem Klonen eines ganzen Organismus - ist ein Vorgang
	bei dem ein Gen aus einem Organismus isoliert und anschlieÃŸend in einen anderen eingepflanzt wird
	beispielsweise ein Plasmid (ein ringfÃ¶rmiges DNA-MolekÃ¼l)
	um das Gen zu vervielfÃ¤ltigen
	PCR wird oft benutzt
	einfÃ¼gt wird (Abb
	mit dem ein Gen in einen Organismus verpflanzt werden kann)
	das dann in einen Vektor (ein Vektor ist ein Mittel
	4)
	in dem das Gen oder sein Produkt besser untersucht werden kann
	Die DNA kann anschlieÃŸend in einen anderen Organismus eingesetzt werden
	Das Exprimieren eines klonierten Gens kann auch zur massenhaften Herstellung nutzbarer Proteine wie z
	BA
	rzneimittel dienen. Abbildung 4: Klonen eines Gens mit Hilfe eines Plasmids. (Die Abbildung stammt vom Autor und wurde Nupedia zur VerfÃ¼gung gestellt.) (1) Chromosomale DNA von Organismus A. (2) PCR. (3) Mehrere Kopien eines einzelnen Gens von Organismus A. (4) EinfÃ¼gen des Gens in ein Plasmid. (5) Plasmid mit dem Gen aus Organismus A. (6) EinfÃ¼gen des Plasmids in Organismus B. (7) VervielfÃ¤ltigung oder Expression des Gens
	das aus Organismus A stammt
	im Organismus B. [Bearbeiten]
Mutagenese
	Mutagenese ist eine MÃ¶glichkeit
	die Sequenz der Nukleotide (Basen) der DNA zu verÃ¤ndern
	um die Funktion eines Gens zu bestimmen
	Es gibt Situationen
	in denen man mutierte (verÃ¤nderte) Kopien eines bestimmten DNA-Strangs benÃ¶tigt
	Mutationen kÃ¶nnen in kopierte DNA-Sequenzen auf zwei grundsÃ¤tzlich verschiedene Arten wÃ¤hrend des PCR-Prozesses eingefÃ¼gt werden
	an spezifischen Stellen auf dem DNA-Strang Mutationen zu erzeugen
	Gezielte Mutagenese erlaubt es dem Forscher
	Meist wird die gewÃ¼nschte Mutation in die Primer integriert
	die fÃ¼r die PCR verwendet werden
	ZufÃ¤llige Mutagenese beruht hingegen auf der Verwendung von fehlertrÃ¤chtigen Polymerasen in dem PCR-Prozess
	Bei der zufÃ¤lligen Mutagenese kÃ¶nnen Ort und Art der Mutationen nicht beeinflusst werden
	Eine Anwendung der zufÃ¤lligen Mutagenese ist die Analyse der Struktur-Funktions-Beziehungen eines Proteins
	Nach zufÃ¤lliger VerÃ¤nderung der DNA-Sequenz kann man das entstandene Protein mit dem Original vergleichen und die Funktion aller Teile des Proteins bestimmen. [Bearbeiten]
Analyse alter (fossiler) DNA
	In manchen Fossilien ist DNA noch in BruchstÃ¼cken vorhanden
	Allerdings sind die Mengen
	meist sehr klein
	die direkt gewonnen werden kÃ¶nnen
	die tausende von Jahren alt ist
	DNA zu analysieren
	Mittels der Klonierung der Fragmente durch PCR wird es mÃ¶glich
	wobei die Anwendungen von der Untersuchung Ã¤gyptischer Mumien bis zur Identifizierung eines russischen Zars reichten
	aber auch an menschlicher DNA
	PCR-Techniken wurden erfolgreich bei Tieren wie einem vierzigtausend Jahre alten Mammut eingesetzt
	Die durch PCR vervielfÃ¤ltigte DNA wird sequenziert
	Aus der Abfolge der Basenpaare im Vergleich zu anderen Sequenzen kÃ¶nnen dann RÃ¼ckschlÃ¼sse auf die Verwandtschaft gezogen werden
	dass die heutige Menschenart Homo sapiens nicht aus dem Homo neanderthalensis hervorgegangen ist
	obwohl beide zeitgleich in Europa existierten. [Bearbeiten]
	Durch diese Methode wurden beispielsweise Hinweise darauf gewonnen
WeiterfÃ¼hrende Literatur
	Zu PCR (Polymerase-Kettenreaktion) : Newton
	C
	R. and A
	Graham
	PCR: Introduction to Scientific Techniques
	2d. ed
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	Oxford: BIOS Scientific Publishers Ltd.
	1997. - ISBN 1872748821 Saiki
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	Scharf
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	Mullis
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	rlich. "Primer-Directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase." Science 239 (1988): 487-491. United States Patent 5
	493 Mullis
	et alA
	edD
	Berkeley (sunsite.berkeley.edu/PCR/) Zum Genetischen Fingerabdruck (Genetic Fingerprinting) : Ballantyne
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	1997: System for automated performance of the polymerase chain reaction PCR Project: Making PCR (Polymerase Chain Reaction) at University of California
	ugust 12
	NA Technology and Forensic ScienceC
	1989. Billings
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	NY: Cold Spring Harbor Laboratory
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	NA on Trial: Genetic Identification and Criminal JusticeC
	1992. Saiki RK
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	Erlich
	and N
	Arnheim. "Enzymatic Amplification of Beta-Globin Genomic Sequences and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle-Cell Anemia." Science 230 (1985): 1350-1354. [Bearbeiten]
Siehe auch
	Sequenzanalyse
	Elektrophorese
	Ligase-Kettenreaktion [Bearbeiten]
Weblinks
	http://hepatitis-c.de/pcr1.htm http://www.roche-applied-science.com/PROD_INF/MANUALS/pcr_man/start.html Polymerase-Ketten-Reaktion (http://sina.eetezadi.de/inhalt/referate/dna-replikation-pcr/page/3) - Kurze Zusammenfassung mit Schema The World Famous PCR Jump Station: Polymerase Chain Reaction (http://www.highveld.com/pages/pcr.html) - englischsprachige Seite zu allen praktischen Aspekten der PCR Beurteilung: Dieser Artikel ist in die Liste exzellenter Artikel aufgenommen worden. ca:PCR en:Polymerase chain reaction es:ReacciÃ³n en cadena de la polimerasa fr:RÃ©action en chaÃ®ne par polymÃ©rase it:PCR ja:PCR nl:Polymerase-kettingreactie pl:Reakcja Å‚aÅ„cuchowa polimerazy pt:PCR sv:PCR

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WeiterfÃ¼hrende Literatur

Siehe auch

Weblinks